食品安全與動(dòng)植物檢疫是保障公眾健康、維護(hù)生態(tài)安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來(lái)，食品市場(chǎng)中“牛肉摻馬肉”“羊肉摻鴨肉”“名貴中藥材以偽代真”等物種摻假問(wèn)題頻發(fā)，不僅損害消費(fèi)者權(quán)益，還可能引發(fā)過(guò)敏、食源性疾病等風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，外來(lái)物種入侵（如紅火蟻、假高粱）及疫病載體物種（如攜帶禽流感病毒的野禽）的快速識(shí)別，也對(duì)檢疫檢測(cè)的時(shí)效性與準(zhǔn)確性提出更高要求。

傳統(tǒng)物種鑒定方法存在明顯局限：形態(tài)學(xué)鑒定依賴(lài)專(zhuān)業(yè)經(jīng)驗(yàn)，無(wú)法識(shí)別破碎、加工后的樣本；普通PCR需電泳驗(yàn)證，操作繁瑣且無(wú)法定量；進(jìn)口熒光定量PCR儀則存在成本高、售后響應(yīng)慢等問(wèn)題。博清生物科技（南京）有限公司作為國(guó)產(chǎn)儀器代表，其研發(fā)的熒光定量PCR儀具有高性?xún)r(jià)比、適配國(guó)產(chǎn)試劑、操作便捷等特點(diǎn)。本研究通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)體系，系統(tǒng)驗(yàn)證該儀器在物種鑒定中的性能，為其推廣應(yīng)用提供科研依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、樣本來(lái)源：實(shí)驗(yàn)用牛肉、豬肉、羊肉、雞肉、三文魚(yú)、鱈魚(yú)、西洋參、人參等樣本均采自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；檢疫截留樣本（疑似攜帶外來(lái)物種卵的木材、進(jìn)口凍品）由當(dāng)?shù)睾ｊP(guān)提供。

2、試劑：動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMan? Probe qPCR Mix、目標(biāo)物種特異性引物與探針。

3、儀器：博清生物熒光定量PCR儀、超微量分光光度計(jì)、高速離心機(jī)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣本前處理與DNA提取

肉類(lèi)/水產(chǎn)品樣本：取50mg組織，經(jīng)液氮研磨后，用動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，操作嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)。

中藥材樣本：取100mg粉末，用植物基因組DNA提取試劑盒去除多糖、多酚干擾，提取總DNA。

檢疫樣本：木材樣本刮取表面粉末，凍品樣本取100mg組織，按對(duì)應(yīng)試劑盒提取DNA。

用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度（A260/A280值1.8~2.0為合格）與濃度，并用無(wú)酶水稀釋至100ng/μL備用。

2、引物與探針設(shè)計(jì)

以物種保守基因序列為靶點(diǎn)，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，設(shè)計(jì)特異性引物與TaqMan探針，確保僅對(duì)目標(biāo)物種產(chǎn)生熒光信號(hào)，無(wú)交叉反應(yīng)。

3、qPCR反應(yīng)體系與程序

反應(yīng)體系（20μL）：2×TaqMan Probe qPCR Mix 10μL，上游引物（10μmol/L）0.8μL，下游引物（10μmol/L）0.8μL，探針（5μmol/L）0.4μL，DNA模板2μL，無(wú)酶水6μL。空白對(duì)照以無(wú)酶水替代模板，陰性對(duì)照以非目標(biāo)物種DNA為模板。

反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 30s；擴(kuò)增階段40個(gè)循環(huán)（95℃ 5s，60℃ 30s，熒光信號(hào)采集于60℃階段）；溶解曲線(xiàn)分析（60℃→95℃，升溫速率0.1℃/s）。

4、儀器性能驗(yàn)證

特異性驗(yàn)證：以目標(biāo)物種與非目標(biāo)物種DNA為模板，檢測(cè)熒光信號(hào)，判斷是否存在交叉反應(yīng)（Ct值＞38或無(wú)擴(kuò)增為陰性）。

靈敏度驗(yàn)證：將目標(biāo)物種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（濃度10?~101copies/μL）梯度稀釋?zhuān)瑱z測(cè)最低檢出濃度，分析Ct值與濃度的線(xiàn)性關(guān)系（R2≥0.99為合格）。

重復(fù)性驗(yàn)證：對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)（批內(nèi)重復(fù)），連續(xù)3天檢測(cè)（批間重復(fù)），計(jì)算CV值（CV＜5%為合格）。

實(shí)際樣本檢測(cè)：對(duì)100份市場(chǎng)盲樣（宣稱(chēng)“純牛肉丸”“進(jìn)口三文魚(yú)”等）及50份檢疫截留樣本進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)照設(shè)備熒光定量PCR儀的結(jié)果比對(duì)，計(jì)算準(zhǔn)確率。

二、結(jié)果與分析

（一）特異性結(jié)果---

博清生物熒光定量PCR儀對(duì)目標(biāo)物種（牛肉、三文魚(yú)、西洋參）均產(chǎn)生明顯熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)（Ct值22~28），非目標(biāo)物種（豬肉、鱈魚(yú)、人參）及空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增（Ct值＞38），特異性達(dá)100%。表明該儀器可通過(guò)特異性引物-探針體系，精準(zhǔn)區(qū)分目標(biāo)物種與干擾物種，避免假陽(yáng)性。

（二）靈敏度結(jié)果

目標(biāo)物種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度在101~10?copies/μL范圍內(nèi)，Ct值與濃度呈良好線(xiàn)性關(guān)系（R2=0.998~0.999），最低檢測(cè)限為101copies/μL。該靈敏度可滿(mǎn)足微量摻假檢測(cè)需求（如牛肉中摻5%以下馬肉）及檢疫中低濃度樣本（如昆蟲(chóng)卵、微量組織）的識(shí)別。

（三）重復(fù)性結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CV值為0.8%~1.5%；批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，CV值為1.2%~1.8%，均小于2%。表明博清生物儀器的檢測(cè)穩(wěn)定性?xún)?yōu)異，數(shù)據(jù)可靠性高，可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)的重復(fù)性要求。

（四）實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果

100份市場(chǎng)盲樣中，博清生物儀器檢出8份摻假樣本（如“牛肉丸”摻豬肉、“西洋參”摻人參），與進(jìn)口儀器檢測(cè)結(jié)果完全一致，準(zhǔn)確率100%；50份檢疫截留樣本中，檢出3份攜帶外來(lái)物種（如木材中檢出天牛卵DNA），準(zhǔn)確率96%（2份因樣本DNA降解導(dǎo)致假陰性，進(jìn)口儀器同樣未檢出）。整體實(shí)際樣本檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)98%，且單輪反應(yīng)耗時(shí)1.5小時(shí)，較傳統(tǒng)PCR（3~4小時(shí)）效率提升50%以上。

三、討論

本研究證實(shí)，博清生物熒光定量PCR儀在物種鑒定中具備“三高一快”優(yōu)勢(shì)：

（一）高特異性：基于保守基因的引物-探針設(shè)計(jì)，結(jié)合儀器精準(zhǔn)的溫度控制（溫控精度±0.3℃），有效避免交叉反應(yīng)，解決了“近緣物種難區(qū)分”的問(wèn)題（如牛肉與馬肉、西洋參與人參）。

（二）高靈敏度與重復(fù)性：最低檢測(cè)限達(dá)101copies/μL，可檢測(cè)微量摻假或低濃度檢疫樣本；CV值＜2% 的穩(wěn)定性，確保不同批次、不同操作人員的檢測(cè)數(shù)據(jù)一致，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求。

（三）高效率：1.5小時(shí)完成單輪檢測(cè)，且儀器支持96孔板同時(shí)運(yùn)行，可滿(mǎn)足批量樣本篩查需求（如食品企業(yè)原料驗(yàn)收、海關(guān)集中檢疫），較傳統(tǒng)方法大幅縮短檢測(cè)周期。

與進(jìn)口儀器相比，博清生物儀器還具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)：儀器采購(gòu)成本降低40%~50%，適配國(guó)產(chǎn)試劑（價(jià)格僅為進(jìn)口試劑的1/3），且售后響應(yīng)時(shí)間＜24小時(shí)，更適合基層實(shí)驗(yàn)室及中小企業(yè)推廣應(yīng)用。

本研究仍存在局限：目前僅驗(yàn)證了12種常見(jiàn)物種的檢測(cè)體系，未來(lái)需擴(kuò)展更多物種（如珍稀動(dòng)物、外來(lái)入侵植物）的引物-探針庫(kù)；針對(duì)高脂肪、高色素樣本（如動(dòng)物內(nèi)臟、深色中藥材）的DNA提取干擾，需進(jìn)一步優(yōu)化前處理方法。后續(xù)可結(jié)合多重qPCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)“一次反應(yīng)檢測(cè)多種物種”，進(jìn)一步提升檢測(cè)效率。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在食品安全物種摻假檢測(cè)與動(dòng)植物檢疫物種鑒定中，表現(xiàn)出高特異性、高靈敏度、高重復(fù)性與高效率的綜合性能，且成本可控、操作便捷。該儀器可作為國(guó)產(chǎn)替代方案，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)企業(yè)、市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)、海關(guān)檢疫機(jī)構(gòu)等場(chǎng)景，為保障食品安全與生態(tài)安全提供有力的技術(shù)支持。